مراجعة الطرق البيوكيميائية للكشف عن البكتيريا سالبة الجرام
من أجل دراسة وتحديد الكائنات الحية الدقيقة ، يجب زراعتها بطريقة أو بأخرى في بيئات مناسبة من حيث الظروف الفيزيائية والكيميائية. أدت العديد من الدراسات حول الكائنات الحية الدقيقة وكيفية عيشها إلى تطوير مجموعة واسعة من وسائط الثقافة بمركبات مختلفة للاستخدام في المختبرات الميكروبيولوجية. يتم استخدام وسائط الثقافة الخاصة والمواد الكيميائية المحددة لتحديد كل
مجموعة أو مجموعة من الكائنات الحية الدقيقة.
خطوات عامة لعزل البكتيريا من العينات
في حالة فصل الكائنات الحية الدقيقة ، كما تشير الكلمة ، فهي بين الرافعة وعزل الميكروب عن مجموعة مختلطة مترابطة في الطبيعة وفي النظم البيئية. في مناقشة فصل كائن حي دقيق أو مجموعة ميكروبية معينة ، يُعتبر هدفًا ويتم تصميم الطريقة بحيث يمكن فصل الميكروب أو مجموعة الميكروبات عن الماهوجني. تحتوي الكائنات الحية الدقيقة المختلفة على تعليماتها الخاصة ، ولكن ما يجب شرحه في بداية مثل هذه المناقشة هو أن خطوات الحالة الثابتة يتم إصلاحها في جميع أنواع الانفصال تقريبًا.
التخصيب: في هذه المرحلة ، يزداد عدد الميكروبات المحددة والمرغوبة التي قد لا تكون مهمة بين الكائنات الحية الدقيقة الأخرى في العينة بطريقة خاصة ، مثل الثقافة في وسط ثقافة مناسب وغني.
القتل الانتقائي: كخطوة ثانية في عزل الكائنات الحية الدقيقة ، عادة ما تستخدم بيئة القتل الانتقائي لمنع نمو الكائنات الحية الدقيقة الأخرى المقلقة.
التنقية: في هذه المرحلة ، من الضروري تحضير الكائنات الحية الدقيقة المختارة والمتنامية في المرحلة السابقة كزراعة نقية وإعدادها لتحديد الهوية أو أي اختبار جرثومي آخر. يشيع استخدام الثقافة الخطية للحصول على أحادية الفصيلة البكتيرية.
التعريف: يتم استخدام طرق مختلفة لتحديد الكائنات الحية الدقيقة المعزولة. يمكن تقسيم هذه الأساليب بشكل رئيسي إلى مجموعتين تتعلق بالزراعة وغير المزروعة. تستخدم الأساليب المتعلقة بالزراعة أنواعًا مختلفة من وسائط الاستزراع ، خاصة الوسائط المتمايزة ، وتحديد الكائنات الحية الدقيقة في البيئة بناءً على الاختلاف في التفاعل. هناك العديد من الجداول والتعليمات المتاحة للباحثين لهذا الغرض. أحد أشهر وأهم كتاب من أربع أوراق للتعرف على البكتيريا [2] هو.
التخزين: أخيرًا ، بعد فصل كائن دقيق معين من العينة ، يمكن تخزينه في المختبر لأي اختبار لاحق. يتم استخدام طرق مختلفة لهذا الغرض. على سبيل المثال ، للتخزين على المدى القصير للبكتيريا ، يمكن زراعتها على سطح وسط الاستزراع البصري باتجاه Agar [3] أو ، باختصار ، TSA ، التي يتم تحضيرها على سطح مائل [4] وتخزينها في الثلاجة. للتخزين طويل الأمد للبكتيريا ، يمكن استخدام الثقافة البكتيرية المركزة في وسط مزرعة الحليب الخالي من الدسم. طريقة أخرى للحفاظ على البكتيريا لفترة أطول هي نقل الثقافة البكتيرية المركزة إلى حجم متساوٍ من الجلسرين المعقم في أنبوب دقيق. يمكن أن تحافظ هذه الأنابيب الدقيقة على محتويات الخلية البكتيرية عند -80 درجة مئوية في مجمدات خاصة لفترة طويلة. غالبًا ما يتم استخدام كريات الدم البيضاء لإبقاء البكتيريا في الخليج لفترة طويلة[5] يتم ذلك. في هذه الطريقة ، يتم استنزاف الثقافة البكتيرية في فراغ ودرجة حرارة منخفضة ، وفي النهاية يتم الحصول على بكتيريا البياض الدقيقي ، والتي يمكن تخزينها في قوارير صغيرة بدون أبواب وذابت رؤوسها لفترة طويلة جدًا.
تعليمات عامة لصنع أنواع مختلفة من وسط الثقافة
تنقسم بيئات الزراعة إلى ثلاث فئات: صلبة وشبه صلبة وسائلة. عادة ما تفتقر البيئات السائلة إلى أجار أو تحتوي على محتوى أجار منخفض جدًا. البيئات شبه الصلبة بكميات صغيرة من الأجار ؛ حوالي 2-3 جرام لكل لتر من مستنبت المواد الصلبة والمواد الصلبة لديها 10 إلى 15 جرامًا من الأجار لكل لتر من مستنبت. لصنع وسائط استنبات بكتيرية ، نستخدم مسحوقًا خاصًا موجودًا في الحاوية ذات الصلة. على هذه النظارات ، يتم كتابة تكوين البيئة بالكامل ، وكذلك كيفية صنعها. أولاً ، يتم وزن الكمية المطلوبة من المسحوق وإضافته إلى كمية معينة من الماء المقطر ، والذي تم سكبه بالفعل في قارورة Erlenmeyer أو وعاء مناسب ، ونقوم بإذابته تمامًا. أو تسخين الميكروويف. عند الغليان ، رجها عدة مرات لتذوب جيدًا وتغلي لمدة دقيقة واحدة. بعد غليان السائل وعدم رؤية الجسيمات المعلقة وغير القابلة للذوبان ، قم بإزالته من الحرارة وتغطيته بورق الألمنيوم على كرة قطنية ووضع الحاوية في الأوتوكلاف للضغط على 15 رطلاً لكل بوصة مربعة والحرارة إلى 121 درجة مئوية لفترة من الوقت. عقم لمدة 15 دقيقة. بعد هذه الخطوة ، اترك وسط الثقافة يبرد. عندما تصل درجة الحرارة إلى حوالي 40 إلى 50 درجة مئوية ، أمسك قارورة Erlenmeyer في يدك اليمنى والقطن بيدك اليسرى بجوار اللهب. صب المحلول السائل في وسط الاستزراع. بجانب الشعلة ، نضع الأطباق لتبرد وتجنب اهتزازها وتحريكها دون داع. بعد ترسيخ وسائل الإعلام الثقافية ، نجمعها ونضعها في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
وينطبق الشيء نفسه على بيئات الزراعة الأخرى ، حيث يتم سكب بعض المواد الصلبة في أنابيب الاختبار بعد الغلي ثم تعقيمها ، والتي يتم تعقيمها أو تنعيمها بعد التعقيم ، مثل وسيط SIM أو المنحدر. مثل بيئة TSI لتبرد.
بعد الغليان ، نقسم الوسط إلى قوارير أو أنابيب اختبار لصنع وسيط سائل ، ثم نحبسها بصوف القطن ونضعها في جهاز التعقيم للتعقيم.
الإلمام ببعض وسائط الثقافة الأكثر شيوعًا المستخدمة في مختبرات علم الأحياء الدقيقة:
١ - مولر - هيلتون أجار ميديوم ] ٦ [
تمت التوصية بوسيط الاستزراع هذا لاختبار مدى قابلية الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض للمواد المضادة للمضادات الحيوية والسلفوناميدات في العينات السريرية وفقًا لطرق كيربي بافير وإريكسون. هذه الوسيلة ، كوسيلة غذائية أساسية ، مناسبة لدراسة المضادات الحيوية. أجار مولر-هينتون الذي يحتوي على ضخ الحيوانات ، وأحماض كازامينف [7] والنشا ، وكذلك الثقافة تفتقر تمامًا إلى مضادات سلفوناميد. هذه البيئة يمكن أن تعزز نمو الكائنات الحية.
إن وجود النشا في هذه البيئة يخلق خاصية التخزين المؤقت فيه ، لذلك يمكن أن يكون مقاومًا إلى حد ما لتغيرات الأس الهيدروجيني ؛ تنتج بعض البكتيريا أيضًا نواتج الأيض التي تمنع نشاط المضادات الحيوية التي تزيل النشا. في M ر ller-Hinton ، تحتوي الأملاح مثل ca و mg على تركيز يساوي تركيز الجسم ، ولا تحتوي على مثبطات لبعض المضادات الحيوية ، ولها تركيزات عالية من قواعد الثيمين والزعتر.
2- مستنبت اوزين ازرق الميثيلين
يحتوي وسط الاستزراع البكتيري في Eosin Methylene Bell على سكر اللاكتوز وأملاح الصفراء (يوزين وأزرق الميثيلين) كمثبطات ، والتي تشكل مستعمرة وردية إذا نمت البكتيريا التي تستهلك اللاكتوز. إذا تطورت المستعمرة عديم اللون ، لا يتم استهلاك اللاكتوز ، لذلك تعتبر هذه البيئة وسيطًا تفاضليًا للبكتيريا بناءً على ما إذا كان اللاكتوز مستهلكًا أم لا. EMB أو Eosin Methylene Blog Agar هو وسيط متميز وانتقائي.
السمة الخاصة لوسط ثقافة EMB هي البريق المعدني لبكتيريا Ecoli عليها. لذلك ، فإن وسط زراعة أجار EMB هو وسيلة استزراع محددة للبكتيريا Ecoli.
تخمر البكتيريا سالبة الجرام البكتريا المعوية ، مثل الأوكاليبتوس واللاكتوز المعوي.
مستعمرات إيكولا في بيئة الإدارة الانتخابية لها بريق معدني أخضر.
Enterobacteriaceae في هذه البيئة تخلق مستعمرات وردية تحتوي في بعض الأحيان على بقع أرجوانية في المركز (عيون الأسماك).
تنمو البكتيريا سالبة الجرام Proteus vulgaris و Salmonella typhimurium في بيئة الإدارة الانتخابية ولكنها لا تخمر سكر اللاكتوز.
3- بيئة زراعة أجار البلد
دائرة الزراعة المزروعة المزروعة تحتوي بيئة المحاصيل العامة على معظم العناصر الغذائية اللازمة لنمو البكتيريا. إنها بيئة غنية جدًا لنمو البكتيريا القوية مثل المكورات العقدية. يتم استخدام هذه الوسيلة لعزل ومضاعفة البكتيريا التي يصعب نموها والبكتيريا المسببة للأمراض التي تحتاج إلى المغذيات للنمو. لا تنمو المكورات العقدية بسهولة في البيئة الطبيعية ولكنها تنمو بشكل جيد في البرية ، لذلك يمكن اختبار وجود إنزيم Hemolysin في البكتيريا باستخدام هذه الوسيلة. بناءً على شكل المستعمرة البكتيرية في وسط زراعة الأجار ، يمكن تحديد نوع البكتيريا. وتتكون من وسيط أساسي مثل التربتون ، وهو من أصل بروتيني وكلوريد أجار الصوديوم و 5٪ من الدم.
لجعل هذه البيئة ، يجب خلط أجار الصويا التربتبي مع 5 ٪ من دم الأغنام الموهنة. لهذا الغرض ، بعد تعقيم الوسط القاعدي ، عند درجة حرارة حوالي 50 درجة مئوية ، نضيف 5 إلى 7 ٪ من دم مزيل الرجفان للأغنام إلى الوسط القاعدي ونصبها في أطباق معقمة وفقًا للظروف المعقمة. واحدة من أهم الخطوات في صنع هذه البيئة هي درجة الحرارة المحيطة في وقت إضافة الدم ، لأنه إذا كانت درجة الحرارة المحيطة عالية في هذا الوقت ، فسوف تتحلل خلايا الدم الحمراء ويتشكل وسيط استزراع الشوكولاتة.
ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن الدم يمنع أيضًا نمو بعض البكتيريا ، وبعض البكتيريا غير قادرة على النمو في بلد أغار ؛ ولكن إذا كانت البكتيريا مصابة بانحلال الدم ، فهذه علامة على أنها مسببة للأمراض. تشمل أنواع انحلال الدم في بيئة بلد أجار ما يلي:
ألفا: زلة غير كاملة في البيئة
بيتا: انزلاق كامل في البيئة
جاما: لا انزلاق في البيئة
4- بيئة Crybler [10]
وسط ثقافة Krebler هو وسيلة نقل لنقل عينات المرضى. هذا الوسط (الرقم الهيدروجيني = 8.4) هو وسيلة انتقال مناسبة للعديد من مسببات الأمراض المعوية.
تلوين دافئ
النوع الأكثر شيوعًا من الطلاء المركب هو النوع الدافئ. هذه هي الطريقة الأكثر فائدة لاكتشاف البكتيريا. في عام 1884 ، اكتشف عالم الأحياء الدقيقة الدنماركي هانز كريستيان غرام تفاعلًا عن طريق الخطأ تم تسميته لاحقًا تفاعل جرام. وفقًا لذلك ، تنقسم البكتيريا إلى قسمين كبيرين وعامين وفقًا لهيكل جدار الخلية (الخلية): البكتيريا الموجبة والسالبة الجرام. والفرق الرئيسي بين المجموعتين هو الاختلافات الهيكلية بين النوعين. في الأنواع إيجابية الجرام ، يتم استخدام نوع من عديد السكاريد في جدار الخلية ويكون جدار الخلية أكثر سمكًا قليلاً ، بينما في جدار الخلية يستخدم النوع السلبي للجرام المزيد من الدهون وجدار الخلية أرق قليلاً من النوع السلبي للجرام. في البقع الساخنة ، لوحظت البكتيريا إيجابية الجرام بعد تلوين الأرجواني والبكتيريا سلبية الجرام باللون الأحمر. وفقا لذلك ، في الرسم الساخن ، بسبب هذا الاختلاف المهم في جدار الخلية ، يتم استخدام نوعين من الدهانات ، واللون الأساسي هو الكريستال القارورة. عند إضافة المحلول البلوري للفيولا إلى الانتشار البكتيري ، تتحد الصبغة مع النيوكليوتيدات في جدار الخلية لتشكيل المعقد البلوري للفيولا ريبونوكليت ، وبعد غسل الصبغة الزائدة ، يتم تطبيق محلول اليود. يرتبط محلول اليود هذا ، وهو مركب معدني ، بالصبغة ويشكل مركب لوني غير قابل للذوبان يسمى مركب بلوري اليود فيفو ، والذي يرتبط في الطرف الآخر بالنيوكليوتيدات في جدار الخلية ويشكل بلورات اليود-ريبونوكليوليت ، في حين البكتيريا السالبة لصبغة جرام لا تشكل مثل هذا المعقد. هذه الرابطة مستقرة للغاية في البكتيريا إيجابية الجرام ولا يتم تفتيتها في الخطوة التالية بواسطة الصبغة وتحتفظ باللون البنفسجي للأرجواني البنفسجي ، لذلك تظهر البكتيريا إيجابية الجرام تحت المجهر الأرجواني.
من ناحية أخرى ، في جدار الخلية للبكتيريا سالبة الجرام ، يتم استخدام المزيد من الدهون ، وبالتالي فإن الدهون في الكحول ستان ، والتي يتم استخدامها كصبغة في الخطوة التالية ، قابلة للذوبان. ونتيجة لهذا التفاعل ، تتم إزالة الدهون من جدار الخلية. يخرج اللون البلوري للأنبوب أيضًا من السطح البكتيري. مع إزالة الصباغ من الدهون ، يزداد حجم مسام جدار الخلية ، مما يتسبب في تغير لون البكتيريا سالبة الجرام بسرعة. في هذه المرحلة ، يتم مسح البكتيريا سالبة الجرام من فيولا الكريستال. لذلك ، بعد الشطف بالماء وإضافة صبغة ثانية ، الزعفران (Fushin) ، يتم امتصاص الصبغة في جدار الخلية للبكتيريا سالبة الجرام وتتحول البكتيريا إلى اللون الأحمر ، وعند الفحص المجهري ، تظهر البكتيريا سلبية الجرام باللون الأحمر.
كيف تقوم بالعمل :
تحضير الانتشار على الشريحة: أولاً ، يتم تحضير انتشار على الشريحة من العينة البكتيرية.
التلوين باستخدام الكريستال البنفسجي: في هذه المرحلة ، يتم سكب قطرة صغيرة من طلاء الكريستال البنفسجي على سطح الميكروبات المنتشرة على الشريحة وتستريح لمدة دقيقة واحدة للسماح للصبغة باختراق جدار الخلية للميكروبات.
خطوة الغسيل: بعد دقيقة واحدة ، يتم تفريغ الطلاء الزائد على الشريحة ويتم غسل السطح باستخدام الماء المقطر.
خطوة إضافة محلول اليود: انشر بضع قطرات من محلول اليود على الحوض واتركه لمدة دقيقة واحدة. ثم استنزف المحلول الزائد واشطف الشريحة بالماء المقطر.
مرحلة التلطيخ باستخدام الكحول المحمر: يسكب محلول الصبغة الكحولية على النطاق. تتم هذه الخطوة في 15 إلى 20 ثانية. بعد ذلك ، يتم غسل الشريحة بسرعة. هذا سيوقف تغير اللون.
الطلاء بالزعفران: في هذه المرحلة ، يتم تغطية سطح التمدد بصبغة ثانوية ، أي الزعفران ، ويستغرق الصبغ 30 إلى 60 ثانية. ثم قم بتفريغ الطلاء الزائد وغسل الشريحة بالماء المقطر.
قم بطلاء الزجاج الملون ببطء على ورق التجفيف ، لكن الورق لا ينتشر على الموزعة. العينة جاهزة للفحص تحت المجهر.
نظرة عامة على الاختبارات الكيميائية الحيوية الأكثر شيوعًا لتحديد بكتيريا المعوية
بيئة زراعة الحديد الثلاثية السكر
تستخدم هذه البيئة على نطاق واسع في تشخيص البكتيريا المعوية (أفراد عائلة البكتيريا المعوية) ، التي يتم تشكيلها كمنحدر في أنبوب الاختبار وبالتالي توفر مستوى أعلى لنمو البكتيريا. تتم الزراعة في البيئة الصلبة في الأعماق الضحلة. يجب أن يكون عمق بيئة TSI 3 سم وعرضها 3 سم.
يحتوي وسط TSI على كاشف فينولي ، كبريتات حديدية ، ثيوسلفات الصوديوم (للكشف عن إنتاج غاز كبريتيد الهيدروجين) ، وثلاثة سكريات ، جلوكوز ، لاكتوز ، وسكروز. تركيز الجلوكوز في البيئة 0.1 تركيز سكرين آخرين. وبعبارة أخرى ، فإن اللاكتوز والسكروز أعلى بعشر مرات من الجلوكوز. جميع البكتيريا في عائلة تخثر البكتيريا المعوية. في الساعات الست الأولى من الاستزراع ، يصبح سطح الوسط وعمقه متوسطًا ، ولكن لاحقًا ، إذا استخدمت البكتيريا اللاكتوز أو السكروز أو كليهما ، يستمر إنتاج الحمض ويظهر مؤشر الأس الهيدروجيني للفينول علامة صفراء وسيتحول سطح وعمق الوسط إلى اللون الأصفر. إذا لم يتم استخدام اللاكتوز والكربوهيدرات السكروز ، فإن البكتيريا تستخدم البيبتونات البيئية ، ويتطلب تكسير هذه الخلايا الأكسجين ، والذي يتم على السطح وينتج عن الأمينات القلوية ، وبالتالي يصبح سطح البيئة أحمر.
يتراوح نطاق الأس الهيدروجيني للبيئة من 8.6 إلى 4.8. هذه البيئة حمراء قبل الزراعة بسبب وجود زعنفة حمراء. هذه البيئة عبارة عن وسيط استزراع ثلاثي الوظائف ، مما يعني أنه يمكننا إجراء ثلاثة اختبارات تفاضلية باستخدام هذا الأنبوب.
تخمر اللاكتوز
إنتاج H2S
إنتاج الغاز (مثل N 2 و H 2 و 1 )
تخمر اللاكتوز: اختبار مهم ومهم للغاية لتمييز الأنواع البكتيرية عن بعضها البعض.
يتم التعبير عن نتائج هذا الاختبار على شكل كسر ، في هذا الشكل ، يرتبط شكل الكسر بالسطح (المائل) ويرتبط مقام الكسر بالجزء الأسطواني من الأنبوب (العمق).
إذا كان حمض / حمض يعني أن كل من الميل (الوجه) والأسطوانة (الهوائي) أصفر ، فإننا نستنتج أن البكتيريا لديها القدرة على تخمير الجلوكوز واللاكتوز.
إذا كان Alk / Alk يعني كل من الميل (الوجه) والأسطوانة (المقام) يتحولان إلى اللون الأحمر ، فإننا نستنتج أن البكتيريا لا تملك القدرة على تخمير أي من السكرين ، الجلوكوز واللاكتوز.
إذا أصبح ألك / حمض ، فهذا يعني أن الميل (الوجه) يتحول إلى اللون الأحمر ، لكن الأسطوانة (المقام) صفراء ؛ نستنتج أن البكتيريا لديها القدرة على تخمير الجلوكوز ولكن ليس لديها القدرة على تخمير اللاكتوز.
إنتاج H 2 S : يشير هذا الاختبار من كبريتات الحديد. إذا كان كبريتات الحديد H 2 S مزيج جنبا إلى جنب من الأسود، حتى إذا البكتيريا + H 2 S هو الرواسب السوداء في الأنابيب نراه.
إنتاج الغازات: تنتج بعض البكتيريا غازات مثل N 2 و H 2 في مساراتها الأيضية . إذا كانت البيئة صحية الشكل ؛ إنتاج الغاز سلبي ، ولكن إذا كانت البيئة مجزأة ومسامية ، فإن إنتاج الغاز إيجابي. في بعض الحالات ، سترى فقاعة كبيرة تشير إلى ارتفاع إنتاج الغاز.
يمكن تلخيص ما سبق على النحو التالي:
الأصفر سطح / عمق الأصفر والغاز الإيجابي، H 2 ق سلبية
سطح أصفر / عمق أصفر ، غاز إيجابي ، H 2 s إيجابي
سطح أحمر / عمق أصفر ، غاز إيجابي ، H 2 s إيجابي
سطح أحمر / عمق أصفر ، غاز سلبي ، H 2 s إيجابي
أحمر سطح / عمق أحمر والغاز سلبي، H 2 ق سلبية
يمكن تقسيم الجهير الساخن السلبي إلى خمس مجموعات بناءً على التفاعل الناتج في هذه البيئة:
في المجموعة الأولى ، يؤدي تخمير الجلوكوز واللاكتوز والسكروز إلى تحمض (اصفرار) البيئة بأكملها وإنتاج الغاز.
عندما يتم زراعة عمق وسطح الوسط ببكتيريا المجموعة الرابعة والثالثة ، تبدأ البكتيريا المستنبتة أولاً في استهلاك الجلوكوز في الهواء ثم لا هوائياً. عندما تكون كلتا الطريقتين في مكانهما (الساعات الأولى من الحضانة) ، يكون الرقم الهيدروجيني لجميع أجزاء وسط الثقافة حامضيًا وبالتالي تكون البيئة صفراء. يصل ويبدأ البكتيريا في تحطيم الببتون في البيئة. يتم إنتاج تحلل الببتون تحت الظروف الهوائية واللاهوائية والأمونيا (Nh3). منتجات هذه العملية لها خصائص قلوية ونتيجة لذلك ، يصبح لون السطح أحمر مرة أخرى. في الوقت نفسه ، يظل عمق البيئة حمضيًا وأصفرًا بسبب المسار الأكثر هدوءًا للتخمر اللاهوائي للجلوكوز.
المجموعة الخامسة تتحلل العصيات السلبية غير المدمرة الجرام ، مثل أنواع الزائفة ، إلى البيبتونات في البيئة ، وتحمر سطح وعمق البيئة دون إنتاج غاز.
كيف تقوم بالعمل :
باستخدام اليانسون المعقم البارد ، انقل العينة البكتيرية من مركز المستعمرة التي نمت مؤخرًا على صفيحة الوسط المستخدم في الثقافة البكتيرية المعوية إلى السطح المنحدر لـ TSI Agar وزرعته عن طريق تحريك فتحة الشرج على طول السطح المنحدر. ثم نقوم بتحصين العمق من خلال ثقب البيئة. نحن نحتضن الأنابيب ذات الأغطية المفككة لمدة 18-24 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو هوائي هوائي.
اختبار فينيل ألانين دمينيز
فينيل ألانين هو حمض أميني يتم تحويله إلى حمض فينيل بيروفيك أثناء نزع المعادن منه. يساعد الاختبار في تشخيص Proteus و Morganla و Provenceia من البكتيريا سالبة الجرام الأخرى.
خطوات القيام :
1- في الأنبوب المحتوي على وسط أجار فينيل ألانين ، يتم تلقيح سطح مستنبت مع مستعمرة معزولة وفي الأنبوب ، يتم فكها.
2- يحضن أنبوب الاختبار لمدة 18 إلى 24 ساعة عند 35 درجة مئوية.
3. إضافة أربع إلى خمس قطرات 10 ٪ من الكلوروفيل مباشرة إلى سطح الأجار. ندير الأنبوب بحيث تكون المستعمرات مغمورة فيه.
يشير ظهور اللون الأخضر مباشرة بعد صب الكاشف إلى أن الاختبار إيجابي.
اختبار السيد / نائب الرئيس (مشتري الميثيل الأحمر والخضروات)
اختبار MR / VP هو أحد الاختبارات التشخيصية للبكتيريا المعوية. يستخدم هذا الاختبار للتحقق من المنتج النهائي للتخمر البكتيري. يحتوي وسط MR / VP على الجلوكوز وفوسفات الدفتيريا. يتمتع جميع أعضاء الجراثيم المعوية بالقدرة على تخمير الجلوكوز ، ولكن بطريقتين مختلفتين ؛ أحدهما خليط حمضي والآخر هو تخمر كحولي. يستخدم وسط الميثيل ريد (MR) للكشف عن البكتيريا التي تنتج خليطًا من الأحماض في تخمر المخاليط الحمضية (بما في ذلك حمض اللاكتيك ، حمض السكسينيك ، وحمض الفورميك المشتق من الجلوكوز في وسط MR.VP). طريق آخر لتخمر سكر الجلوكوز هو إنتاج بوتيل جليكول:
بوتلين جلايكول ، أسيتون ، حمض البيروفيك ، الجلوكوز
في هذه الحالة ، تكون حموضة البيئة منخفضة ويستخدم كاشف VP. في هذه الحالة ، MR سلبي. يمكن أن تنتج البكتيريا مثل Celsius ، enterobacteriaceae stevin. في وجود 40 ٪ من الأكسجين في الهواء وهيدروكسيد البوتاسيوم ، يتم تحويل stethoin إلى diacetyl ، ويعمل alpha-phenol كمحفز وينتج لونًا أحمر. يتكون الكاشف VP من جزأين ، ألفا 5 ٪ النفثالين و 40 ٪ هيدروكسيد البوتاسيوم.
خطوات القيام :
1- أولا نقوم بزراعة البكتيريا في بيئة MR-VP.
2- احتضان أنبوب الاختبار لمدة 24 ساعة عند 37.ج.
3- بعد وقت الحضانة نقسم خليط البكتيريا ووسيط الثقافة إلى أنبوبين منفصلين.
4- أضف قطرة كاشف MR الحمراء قطرة قطرة إلى استزراع أحد الأنابيب وفحص التفاعل. إذا كان التخمير بواسطة خليط حمضي ، فإن الكاشف يحتفظ بلونه عند درجة حموضة حمضية ، وإلا يصبح اللون الأحمر للكاشف عديم اللون.
5 - في أنبوب آخر لمزرعة 2.5 سم مكعب ، يتم إضافة ست قطرات من ألفا نافثول وقطرتين من 40 ٪ من البوتاس إلى الوسط ، هز الوسط واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة دون التحرك. بعد هذه الفترة ، إذا كانت بكتيريا VP إيجابية ، سيظهر لون برتقالي على سطح وسط المزرعة.
بيئة SIM
إنها وسيطة شبه صلبة ، وكما يوحي اسمها ، يتم استخدامها لتحديد إنتاج SH2 والحركة البكتيرية.
كيفية الزراعة في البيئة
نظرًا لأن هذه الوسيلة تستخدم للكشف عن الحركة في البكتيريا ، يجب توخي الحذر لإنشاء خط ثقافة عند الزراعة. للقيام بذلك ، خذ عينة من مستعمرة بكتيرية نقية ومعزولة واغمسها برفق في عمق البيئة وأخرجها من البيئة دون مصافحة. لتحديد حركة البكتيريا في هذه البيئة ، بعد حضانة البكتيريا ونموها ، انظر إلى خط الاستزراع.إزالة البكتيريا من خط الاستزراع هي علامة على حركة البكتيريا وإذا كان خط الاستزراع غائمًا فقط ، فهو علامة على نقص الحركة في البكتيريا.
1- إذا تم إنشاء لوحة الزراعة بدلاً من خط الزراعة بسبب اهتزاز اليد أثناء الزراعة ، فلا يمكن استخدام هذه البيئة لتحديد الحركة.
2. في البكتيريا الهوائية ، لأن هذه البكتيريا غير قادرة على النمو في أعماق البيئة ، فإنها تنمو عادة على سطح البيئة وعند نقطة الزراعة. .
3. بعض البكتيريا في بيئة SIM تنتج SH2 عن طريق تجديد المواد الكبريتية العضوية ، التي اسودت مستنبت.
4. قد تنتج البكتيريا SH2 في بيئة TSI وليس SH2 في بطاقة SIM ، والعكس بالعكس.
كيفية تحديد إنتاج إندول في بيئة SIM : بعد الحضانة والنمو البكتيري ، يتم استخدام كاشف محوري أو إرليخ. إذا ظهرت حلقة حمراء على البيئة بعد إضافة كاشف محوري ، فهذه علامة على أن البكتيريا إيجابية. إذا كانت البكتيريا تحتوي على إنزيم تريبتوفاناز ، يمكن أن تنتج حمض أميني تريبتوفان ، إندول ، سكوتول ، وحمض الخليك. يتم استخدام كاشف محوري أو erlich (paradimethyl amino benzaldehyde) لفحص الإندول ، الذي يتكون من تفاعل الإندول مع عامل الألدهيد للمجمع الأحمر.
إنتاج SH2 : مثل البيئات الأخرى المذكورة أعلاه ، تم استخدام ثيوسلفات الصوديوم وسيترات الحديديك الأمونيوم في وسط المزرعة لتقييم إنتاج SH2. يشير تكوين الرواسب السوداء في وسط SIM شفاف إلى إنتاج SH2.
اختبار إندول
يتم إنتاج إندول بواسطة بعض الكائنات الحية الدقيقة في Trypton Bratt. Trypton Brat غني بالحمض الأميني التربتوفان ، والذي تستخدمه هذه البكتيريا كمصدر للكربون والنيتروجين والطاقة. الكائنات الحية التي تحتوي على إنزيم تريبتوفاناز قادرة على تحطيم الأحماض الأمينية تريبتوفان إلى حمض البيروفيك والأمونيا والإندول. يتم تحديد إندول من خلال الجمع مع كاشف الألدهيد وتشكيل منتج ملون. لا يمكن لجميع البكتيريا ، أو حتى جميع البكتيريا المعوية سالبة الجرام ، استخدام التربتوفان والإندول بهذه الطريقة ؛ لذلك ، يمكن أن يكون إنتاج إندول طريقة تشخيصية. يستخدم هذا الاختبار للتمييز بين الأنواع الأوالي التي تحتوي على المجترات عن الأنواع الأخرى وتحديد الإشريكية القولونية المحتملة. قد يكون هذا الاختبار مفيدًا أيضًا للكائنات اللاهوائية. يمكن تحديد Endol ، وهو المنتج النهائي لتحليل التربتوفان بواسطة إنزيم التربتوفاناز ، من خلال قدرته على الاندماج مع بعض الألدهيدات لتشكيل الصباغ. يتسبب الإندول في تلون أزرق-أزرق بالقرب من سينامالديهيد.
خطوات القيام :
ضع قطعة مناسبة من ورق الترشيح (واتمان رقم 1) على أرضية صفيحة واشباعها بكاشف الأندلس.
باستخدام حلقة أو عصا خشبية ، ضع بعض المستعمرات على سطح ورق الترشيح. إذا ظهر تغيير أزرق على الفور ، فهذا يشير إلى اختبار إيجابي. تنتج معظم الكائنات الحية الداخلية الإيجابية اللون الأزرق في 30 ثانية.
اختبار استهلاك سترات [13]
سترات الصوديوم عبارة عن ملح حمض الستريك ومركب عضوي يتم استقلابه في دورة الكربون ويمكن أن يكون مصدرًا للكربون. يمكن لبعض الكائنات الحية الحصول على طاقتها من سترات الصوديوم كمصدر وحيد للكربون ومن أملاح الأمونيوم غير العضوية كمصدر وحيد للنيتروجين. البكتيريا القادرة على استخدام السيترات كمصدر وحيد للكربون والطاقة وملح الأمونيوم كمصدر وحيد للنيتروجين للنمو قادرة على تحويل بيئة سترات السيترون (الأخضر) ، التي تحتوي على كاشف أزرق البروموثيمول ، إلى اللون الأزرق.
تحتوي بيئة أجار سيترات الستر على الأملاح ، الكاتيونات ، مخازن السيترات ، وثيمول البروميد المائي كمؤشر ، ويمكن إنتاجها في الرقم الهيدروجيني القلوي (أعلى من 6.7) وأثناء إنتاج المركبات القلوية (المركبات القائمة على الأمونيوم). وتجدر الإشارة إلى أن أي بيئة تستخدم لتحديد استخدام سترات يجب أن تكون خالية من البروتين والكربوهيدرات كمصادر أخرى للكربون.
خطوات القيام :
نقوم بتلقيح كمية صغيرة جدًا من الكائن المطلوب (1-2 عزلة مستعمرة) على سطح أجار المنحدر لمنحدر سيمون سيترات.
نحضن الأنبوب عند 37-35 درجة مئوية لمدة 24-28 ساعة. يشير إنشاء اللون الأزرق إلى رد فعل إيجابي.
اختبار اليوريا
اليورياز هو إنزيم تنتجه بعض الكائنات الحية ويحلل اليوريا إلى ثاني أكسيد الكربون والماء والأمونيا. يتم تحويل الأمونيا إلى كربونات الأمونيوم في محلول ويقلل البيئة ويرفع الأس الهيدروجيني. يمكن استخدام الاختبار للتمييز بين البكتيريا المعوية ، للتمييز بين أنواع البروسيلا ، لتحديد الأنواع المهمة مثل بكتيريا كورنثيا اليوريا - اليليكتيوم ، هيليكوباكتر بيلوري ، لتحديد خميرة الكبسولة الناجمة عن الحرارة ، واستخدامها كاختبار إضافي.
خطوات القيام :
نحن تلقيح وسط ثقافة Broth مع كميات كبيرة نسبيا من المستعمرات المعزولة.
نحتضن الأنبوب لمدة 48 ساعة عند 37.ج. تتفاعل الكائنات التي تحلل اليوريا بسرعة إيجابية في غضون ساعة إلى ساعتين ، وتتطلب السلالات الأقل نشاطًا 3 أيام أو أكثر من الحضانة. يشير اللون الأحمر إلى تفاعل قلوي وتحلل مائي لليوريا.
إعداد معيار 0.5 McFarland
لتوحيد تركيز التلقيح ، يجب استخدام معيار كبريتات البارومتري (BaSo4) ، الذي يتم إعداده بالطريقة التالية ، لاختبار اختبار الحساسية للمضادات الحيوية.
أضف 0.5 مل من كلوريد الباريوم (W / V BaCl2 / H2O 1.175٪) 0.048 مول / لتر (BaCl2) إلى 0.599 مل من حمض الكبريتيك 0.18 مول / لتر (1٪ V / V) وقلّب. نحن نستعد باستمرار تعليق.
يتم تحديد الكثافة القياسية الصحيحة من خلال تحديد امتزاز هذا التعليق بواسطة مقياس طيفي بقطر 1 سم. يجب أن يكون الامتصاص البصري عند 625 نانومتر بين 0.08 و 0.13.
من المعلق الناتج ، يتم سكب 4-6 ملم في الأنابيب بنفس الحجم أو أنابيب التعليق البكتيرية. يتم إغلاق الأنابيب بإحكام وتخزينها في درجة حرارة الغرفة وفي مكان مظلم. قبل كل استخدام ، يتم تعطيل المعيار بشدة بواسطة قمة ميكانيكية لتحقيق التوحيد المنتظم. إذا لوحظت جسيمات كبيرة ، يتم استبدال المعيار الجديد. يجب استبدال معيار كبريتات الباريوم على أساس شهري أو قياس امتصاصه.
تعليقات